Автономная некоммерческая организация « Центр изучения современной конъюктуры и экспертизы НИФ «Институт актуальных проблем экономики и права» ФГБУН СПб НЦ РАН
Кандидат ветеринарных наук, доцент Святковский А.В.
Генеральный директор« Центр изучения современной конъюктуры и экспертизы НИФ «Институт актуальных проблем экономики и права» кандидат ветеринарных наук, магистр философских наук Лизоркин А.В.
СОВРЕМЕННАЯ МЕТОДОЛОГИЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
(Обзор)
Со времён первой научно обоснованной концепции распространения заразных болезней, учения о “контагии” — живом размножающемся заразном начале, выдвинутой Д. Фракасторо ( итальянский ученый1478-1553), возникла настоятельная необходимость опознавать и систематизировать “некие” возбудители инфекционной патологии. Существенным толчком в реализации этой необходимости явилось изобретение голландским естествоиспытателем А. Левенгуком микроскопа, дающего увеличение в 150-300 раз, благодаря чему Левенгук описал инфузории, лямблии, эритроциты, а также неизвестные образования шарообразной, палочковидной и извитой формы. Обнаруженных живых “зверушек” Левенгук назвал “анималькулюсами”. Дальнейшие исследования многих ученых (в частности, Л.Пастера, П. Э. Дюкло) позволили сформировать науку — микробиологию, которая не могла быть жизнеспособной без чёткой классификации (систематизации) микроорганизмов.
Основные методы микробиологии и соответствующие алгоритмы, применяемые для идентификации и исследования микроорганизмов, включают следующие:
ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
Это классические методы, которые основываются на морфологических, физиологических и биохимических характеристиках микроорганизмов. К ним относятся:
- Морфологический анализ (микроскопия, окраска по Граму и т.д.)
- Культивационные методы (определение колоний, условий роста и т.д.)
- Биохимические тесты (ферментация углеводов, определение активности ферментов и т.д.)
Эти методы послужили фундаментом для создания нашим соотечественником Р.А. Ционом уникального научного труда — «Определителя микробов». Этот классический справочник стал незаменимым инструментом для быстрой и точной идентификации микроорганизмов, открывая исследователям путь к новым открытиям в микробиологии и упрощая работу с разнообразными микробными культурами. Они остаются актуальными, однако фенотипические методы несколько трудоёмки и, в тоже время, могут быть недостаточными для сложных случаев или редких микроорганизмов.
Дальнейшее совершенствование бактериологических исследований требует интеграции современных методов, которые значительно расширяют возможности фундаментальной науки и прикладной (клинической) диагностики поскольку внешние характеристики не отражают всех генетических и биохимических особенностей микроорганизма. В таких случаях для более точной идентификации требуется использование генотипических методов, таких как секвенирование ДНК, которые позволяют выявить уникальные генетические маркеры, отличающие один микроорганизм от другого и расширяют возможности по точности и скорости детерминирования микроорганизмов.
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
Молекулярные методы представляют собой один из самых точных и быстрых способов идентификации микроорганизмов на уровне их ДНК и РНК. Вот основные и наиболее популярные из них:
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР, PCR)
– высокочувствительный быстрый и наиболее точный метод, позволяющий прямо или косвенно обнаруживать определённые фрагменты ДНК и РНК , что значительно ускоряет по сравнению с традиционными культуральными методами процесс идентификации микроорганизмов и диагностики инфекций. Для ПЦР используют специфические праймеры, которые помогают «находить» в образце определённые генетические маркеры (последовательность нуклеотидов генома микроорганизма), что даёт возможность точно определить вид или даже конкретный штамм. ПЦР — традиционный метод использующий амплификацию (увеличения количества) определённых фрагментов ДНК. Однако ПЦР требует сложного оборудования и этапов амплификации, что требует тщательной настройки.
Количественная ПЦР (qPCR)
– усовершенствованный вариант ПЦР. Он не только выявляет микроорганизмы, но и позволяет определить их количество в образце. Это особенно полезно при определении тяжести инфекции или для мониторинга изменений во времени. Разновидность метода – ПЦР в реальном времени (RT-PCR), позволяет не только обнаруживать микроорганизмы, но и оценить их количественно, что важно для диагностики вирусных или бактериальных инфекций .
СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНОМА МИКРООРГАНИЗМОВ
Секвенирование – это метод, позволяющий «прочитать» последовательность ДНК или РНК в образце, словно текст. С его помощью возможно определить, в каком порядке расположены «буквы» генетического кода (аденин, гуанин, цитозин и тимин). Это позволяет понять, какие гены присутствуют в микроорганизме и как они влияют на его функции и свойства.
Секвенирование нового поколения (Next-Generation Sequencing, NGS) – это продвинутый метод, который позволяет за короткое время расшифровать огромные объёмы генетической информации, метод позволяет выявлять патогены напрямую из сложных образцов, таких как кровь или почва. С его помощью можно исследовать полный геном микроорганизма или изучить отдельные участки, например, 16S рРНК у бактерий или ITS-регионы у грибов, которые содержат уникальные последовательности для каждого вида. Это даёт возможность точно идентифицировать даже те виды, которые сложно вырастить в лабораторных условиях или которые встречаются очень редко.
Метагеномное секвенирование (метагеномика) – раздел молекулярной генетики, в котором изучается весь генетический материал, полученный из любых образцов, содержащих биологический материал. Метагеномика позволяет одновременно исследовать ДНК всех микроорганизмов, которые присутствуют в образце (например, в пробе почвы, воды или из кишечника человека или животного). Вместо того чтобы идентифицировать каждый микроорганизм по отдельности, этот метод анализирует всю микробиоту, предоставляя данные о том, какие виды присутствуют, в каких количествах и как они взаимодействуют друг с другом. Это важно для понимания сложных экосистем, например, в организме человека, где множество микроорганизмов живут вместе и оказывают влияние на здоровье.)
Методы метагеномики характеризуются возможностью анализа множественных микробных ассоциаций без необходимости культивирования микроорганизмов. Эти методы важны для изучения экосистем, биологических сообществ и диагностики сложных инфекций. Их основой являются алгоритмы сравнивания полученных последовательностей нуклеотидов в ДНК или РНК тех или иных организмов с базами данных для нахождения соответствий. Наиболее часто в настоящее время используются следующие алгоритмы:
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) – это программный инструмент для быстрого поиска сходных последовательностей ДНК, РНК или белков в базах данных. Он помогает находить участки гомологии между последовательностями, что полезно для идентификации неизвестных генов, поиска ближайших эволюционных родственников или выявления функциональных областей белков. Например, введение в программу полученной последовательности нуклеотидов ДНК приводит к сравнению её с уже известными последовательностями в базе данных. В результате вы получаете список наиболее похожих последовательностей с оценкой их схожести.
BWA (Burrows-Wheeler Aligner) – программа сравнения (алайнмента) коротких фрагментов ДНК или РНК к эталонному геному. Она особенно эффективна при работе с данными, полученными с помощью секвенирования нового поколения (NGS). BWA работает быстро и точно, что делает её популярной в анализе генетических данных больших объёмов, например, в поиске мутаций или вариаций в геноме.
Bowtie – ещё один инструмент для быстрого и эффективного сравнения коротких последовательностей ДНК к эталонным геномам. Он оптимизирован для работы с большим количеством коротких фрагментов, что делает его особенно полезным для анализа фрагментов секвенирования длиной до 50-100 пар оснований, как в данных NGS.
ГЕНОМНОЕ СКРИНИРОВАНИЕ
Скрининг — это метод массового анализа большого количества образцов для выявления каких-то специфических признаков. Например, в биологии и медицине скрининг может использоваться для поиска определённых генетических последовательностей (например, ДНК патогенов или мутаций) в большом числе образцов.
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, Кластеры регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов) — данный термин относится к сегментам ДНК в геномах бактерий и архей, которые играют ключевую роль в их защитной системе против вирусов, а также являются основой технологии CRISPR-Cas, используемой для редактирования генов.
Геномное скринирование CRISPR-технологии можно использовать не только для редактирования генов, но и для детекции микроорганизмов. Например, система CRISPR-Cas может быть модифицирована для обнаружения специфических последовательностей ДНК или РНК патогенов, что обеспечивает высокую специфичность и чувствительность.
По сравнению с ПЦР, CRISPR может находить и связываться с конкретными генетическими последовательностями благодаря системе «наведения» на нужные участки ДНК или РНК с помощью РНК-гидов. Это делает систему более точной. Также CRISPR выполняет детекцию без необходимости амплификации, что сокращает время анализа. Она также может работать в условиях, где оборудование для ПЦР недоступно. Кроме того CRISPR-системы могут обнаруживать несколько разных последовательностей одновременно (мультиплексирование), что позволяет проводить более сложные тесты за один раз.
Технологии CRISPR можно модифицировать для обнаружения специфических последовательностей ДНК или РНК микроорганизмов. Это возможно за счёт использования направляющей РНК (gRNA), которая может быть запрограммирована для распознавания конкретной ДНК или РНК. Например, если мы хотим найти ДНК бактерии в образце, gRNA будет направлять Cas-белок к этому месту, чтобы «прочитать» её. Когда направляющая РНК находит целевую последовательность, белок Cas связывается с этой областью и может «разрезать» ДНК или активировать флуоресцентный сигнал. Это помогает точно определить присутствие определённого патогена, не затрагивая другие последовательности.
Примечательно то, что CRISPR-системы сами по себе являются частью естественных защитных механизмов бактерий. В геноме многих бактерий находятся CRISPR-последовательности, которые представляют собой записи предыдущих «вторжений» вирусов. Эти фрагменты можно анализировать с помощью алгоритмов поиска повторяющихся последовательностей в геноме. Они помогают понять, какие вирусы атаковали бактерию, и проследить историю её инфекций. Т.е. видеть, насколько штаммы близки по эволюционным путям и как они изменялись со временем. Такой анализ полезен для отслеживания изменений в популяциях бактерий, что особенно важно для понимания распространения заболеваний и эволюции патогенов.
АЛГОРИТМЫ СБОРКИ ГЕНОМОВ
Сборка геномных фрагментов в целостные геномы используется для восстановления полных последовательности геномов из коротких фрагментов ДНК, что позволяет диагностировать и анализировать микроорганизмы в сложных ассоциациях.
SPAdes (St. Petersburg genome assembler) — программа для сборки геномов, разработанная в Санкт-Петербургском университете. Она предназначена для работы с данными секвенирования различными способами. Эта программа отлично справляется с сборкой геномов как бактерий, так и эукариот, позволяя получать высококачественные и непрерывные последовательности (контиги). SPAdes использует различные алгоритмы для обработки разных типов данных (одиночные и парные риды) и адаптируется к различной длине фрагментов, что делает его универсальным инструментом для анализа разнообразия геномов и эволюционных исследований.
MEGAHIT — это высокопроизводительная программа для сборки метагеномов , разработанная для обработки больших объёмов данных (терабайты) секвенирования . Она особенно эффективна для работы с данными, полученными из сложных микробиомов, где требуется собрать множество различных геномов одновременно. Программа оптимизирована для быстрой сборки, что позволяет обрабатывать большие наборы данных с минимальными требованиями к памяти. Это особенно полезно при анализе сложных образцов, таких как образцы из почвы или кишечника, а также для анализа микробиомов и экосистем, где важно понимать, как различные микроорганизмы взаимодействуют друг с другом.
MALDI-TOF MS
(Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация — времяпролетная масс-спектрометрия, Matrix—Assisted Laser Desorption/Ionization Time—Of—Flight Mass Spectrometry)
Это современная технология, позволяющая идентифицировать микроорганизмы по их белковому профилю. Этот метод в значительной мере автоматизирует процесс определения микробов и ускоряет процесс идентификации до нескольких минут.
Основные моменты, объясняющие его популярность MALDI-TOF MS следующие:
Высокая точность и чувствительность MALDI-TOF MS позволяет идентифицировать молекулы, такие как белки, липиды, пептиды, нуклеиновые кислоты и другие биомолекулы, с высокой точностью. Он определяет их массу с использованием времени пролета (время, за которое ионизированные частицы достигают детектора), что позволяет определить молекулярную массу с очень малой погрешностью. Это делает его особенно полезным в идентификации микроорганизмов, протеомных исследований и диагностики.
Высокая скорость Одним из ключевых преимуществ MALDI-TOF является его высокая скорость анализа. В типичной лаборатории MALDI-TOF MS может идентифицировать множество образцов за короткий период времени, что делает его отличным выбором для клинической диагностики, где требуется быстрый результат. Например, идентификация патогенов в инфекционных заболеваниях может занять считанные минуты, что значительно сокращает время ожидания результатов.
Подготовка образцов для MALDI-TOF сравнительно проста и требует минимального объема. Как правило, образец смешивают с матрицей (обычно органическая кислота), которая помогает перенести образец в газовую фазу без разрушения молекул. Это минимизирует риск повреждения сложных биомолекул, что делает метод пригодным для работы с деликатными образцами.
Широкий спектр применений MALDI-TOF MS используется в клинических лабораториях для идентификации бактерий, грибов и вирусов. В научных лабораториях он применяется для анализа белков (протеомика), изучения биомаркеров, секвенирования нуклеиновых кислот и диагностики метаболических заболеваний. Это также эффективный инструмент для исследований в фармацевтике и биохимии.
Экономичность метода, по сравнению с традиционными методами молекулярной идентификации (например, секвенированием ДНК), реализуется за счет меньшего времени и реагентов для получения результатов.
Таким образом, в клинической микробиологии MALDI-TOF MS стал стандартом для быстрой идентификации патогенов. При подозрении на инфекцию из образца выделяют микроорганизм, его масс-спектр сравнивают с базой данных, что позволяет быстро определить возбудителя болезни и своевременно начать специфическое лечение.
БИОСЕНСОРЫ
Биосенсоры — это аналитические устройства, которые используют биологические элементы (например, ферменты, антитела или ДНК), связанные с физическими или химическими детекторами для обнаружения различных веществ, в том числе микроорганизмов. Благодаря своей чувствительности и возможности работать в режиме реального времени, они находят широкое применение в медицине, экологии и пищевой промышленности. Биосенсоры могут работать на основе различных физических и химических принципов, таких как оптические и электрохимические.
Оптические биосенсоры используют свет для обнаружения изменений в биологической системе. Это может быть изменение интенсивности, поляризации, длины волны или фазового сдвига света. Они работают на основе взаимодействия света с образцом, что позволяет обнаружить наличие или концентрацию микроорганизмов.
- Флуоресценция и люминесценция: Многие оптические биосенсоры используют флуоресцентные метки, которые связываются с целевыми молекулами или микроорганизмами. Когда метка связывается с микроорганизмом, она испускает свет под воздействием лазера или другого источника света. Этот сигнал регистрируется детектором, позволяя выявить микроорганизм.
- Поверхностный плазменный резонанс (SPR): Этот метод основан на измерении изменений в отраженном свете на поверхности сенсора, который покрыт биологическим материалом. Когда микроорганизмы связываются с этим материалом, меняются параметры отражения света, что позволяет обнаружить наличие патогенов в реальном времени.
Электрохимические биосенсоры измеряют изменения электрических параметров, таких как ток, напряжение или проводимость, возникающие при взаимодействии биологического элемента с микроорганизмами. Эти сенсоры являются чувствительными и могут работать даже в сложных образцах, таких как кровь или сточные воды.
Амперометрические биосенсоры: Эти сенсоры измеряют изменения электрического тока при окислении или восстановлении молекул, что происходит при взаимодействии с микроорганизмами. Например, ферменты могут катализировать реакции, в результате которых выделяются электроны, что изменяет ток.
Потенциометрические сенсоры: Измеряют изменения электрического потенциала на поверхности электродов при взаимодействии с микроорганизмами. Например, изменение pH или концентрации ионов может свидетельствовать о наличии микробов.
Акустические биосенсоры работают на основе изменения акустических волн. Когда микроорганизмы взаимодействуют с биологическим рецептором, изменяется частота или амплитуда волны, что можно измерить. Пример — кварцевые микровесы (QCM), которые измеряют изменение массы, возникающее при связывании микроорганизмов с сенсором.
Термические биосенсоры основаны на измерении изменения тепла, которое выделяется или поглощается при биохимических реакциях. Когда микроорганизмы взаимодействуют с биологическим материалом на поверхности сенсора, это может вызывать экзотермические или эндотермические реакции, что позволяет выявить их присутствие.
В медицине биосенсоры могут использоваться для быстрого выявления патогенов в крови пациента, что позволяет своевременно назначать лечение. В пищевой промышленности их применяют для мониторинга качества продуктов и выявления бактериального загрязнения, например, сальмонеллой или листерией. При этом важны преимущества биосенсоров, заключающиеся в том, что они могут быстро регистрировать присутствие микроорганизмов, что позволяет получать результаты в течение минут или часов, а не дней, как при традиционных методах (например, культивировании бактерий). Кроме того, благодаря использованию биологических молекул, таких как антитела или ДНК-зонды, биосенсоры могут обнаруживать конкретные микроорганизмы с высокой точностью даже при их низкой концентрации. Также повышает ценность этого метода то, что для работы с биосенсорами требуется минимальная подготовка образца, что упрощает процесс и снижает вероятность ошибок.
БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ НАНОТЕХНОЛОГИЙ
Это устройства, которые сочетают в себе биологические компоненты (такие как ферменты, антитела или ДНК-зонды) и наноматериалы для обнаружения специфических биомолекул, характерных для определённых микроорганизмов. Эти сенсоры способны проводить быстрое и точное тестирование без необходимости культивации микроорганизмов, что значительно ускоряет диагностику и анализ.
Нанотехнологии играют ключевую роль в создании биосенсоров благодаря уникальным свойствам наноматериалов.
Наноматериалы как чувствительные элементы, такие как наночастицы золота, углеродные нанотрубки, графен и квантовые точки, имеют большую поверхность по отношению к своему объёму. Это позволяет им связываться с большим количеством биомолекул, что повышает чувствительность сенсора. Например, наночастицы золота могут быть покрыты антителами или участками ДНК, которые связываются с целевыми биомолекулами, специфичными для микроорганизма.
Наночастицы могут значительно усиливать сигнал биосенсора, что делает возможным обнаружение очень малых концентраций биомолекул. Например, в оптических биосенсорах наночастицы золота могут усилить световой сигнал, когда биомолекулы связываются с поверхностью сенсора. Это приводит к высокой чувствительности, что позволяет обнаруживать микроорганизмы на ранних стадиях заражения или при низкой концентрации патогенов в образце, это является идеальным для ранней диагностики инфекций. Кроме того, такие биосенсоры могут напрямую обнаруживать биомолекулы (например, ДНК, белки или антигены), характерные для патогенов, без необходимости культивации. Это значительно ускоряет процесс диагностики.
Биосенсоры на основе нанотехнологий высоко селективны в обнаружении специфических биомаркеров (например, антигенов или фрагментов ДНК), которые точно распознают и связываются с конкретными патогенами. Таким образом, сенсоры могут точно идентифицировать возбудителя, избегая ложных положительных реакций.
Биосенсоры на основе нанотехнологий способны проводить анализы в режиме реального времени, значительно сокращая время ожидания результатов. Например, если традиционные методы, такие как культивирование микроорганизмов, могут занимать несколько дней, нанотехнологические биосенсоры могут обнаружить патогены за считанные минуты или часы.
Биосенсоры на основе нанотехнологий требуют минимальной обработки образцов, что снижает сложность и риск ошибки в процессе анализа. Это особенно важно в условиях, где требуется быстрое принятие решений, например, в экстренной медицинской диагностике или контроле безопасности пищевых продуктов.
МИКРОЖИДКОСТНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
(лаборатория на чипе)
Микрожидкостные (микрофлюидные) технологии (лаборатория на чипе) — передовые устройства, которые представляют собой миниатюрные лаборатории на небольшом чипе. Эти системы позволяют автоматизировать и ускорять биохимические анализы, такие как ПЦР и иммунологические тесты, делая их более быстрыми, экономичными и доступными. Микрожидкостные системы используют микроканалы (капилляры), встроенные в чип, по которым циркулируют небольшие объемы жидкостей (обычно нанолитры или микролитры). Эти каналы могут быть запрограммированы для выполнения сложных лабораторных процедур: смешивания, разделения, реакции и анализа образцов. Сенсоры, встроенные в чип, обнаруживают результаты реакций (например, изменения флуоресценции при ПЦР или наличие антигенов в иммунологических тестах). Все этапы происходят внутри устройства, что значительно упрощает процесс обработки биологических образцов.
Таким образом, в отличие от традиционных лабораторных методов, где анализы могут занимать часы или даже дни, микрожидкостные системы могут выполнять сложные реакции за считанные минуты или часы. Например, ПЦР на чипе позволяет получить результаты анализа генетического материала микроорганизмов в несколько раз быстрее, чем при использовании стандартного оборудования. Из-за малых объемов реакционных компонентов и точного управления потоками жидкостей, микрожидкостные системы обеспечивают высокую точность и чувствительность анализа. Это особенно важно при работе с малым количеством биоматериала, например, крови. Лаборатория на чипе может быть использована вне стационарных лабораторий, что делает её незаменимой для быстрого выявления патогенов в полевых условиях, на местах природных катастроф или в удалённых регионах без доступа к полноценным лабораториям. Например, такие системы могут быть использованы для быстрого выявления инфекций в экстренных ситуациях или для тестирования безопасности продуктов питания, а также для выявления загрязнений воды и почвы, в частности, для быстрого обнаружения опасных микроорганизмов, таких как кишечная палочка, в водоёмах или сточных водах.
ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ (Flow Cytometry)
Проточная цитометрия позволяет исследовать отдельные клетки микроорганизмов, анализируя их размер, структуру и их физиологическое состояние. Этот метод может быть использован для количественного анализа популяций микроорганизмов, их идентификации по размерам, форме и другим параметрам:
Проточная цитометрия — метод, позволяющий исследовать отдельные клетки (в т.ч. микроорганизмы), анализируя их морфологические, физические и химические свойства, а также выявляя определённые маркеры (например, белки на поверхности клетки). В процессе анализа клетки проходят по узкому каналу (потоку), где через них проходят лазерные лучи, и каждая клетка взаимодействует с этим светом. Специальные датчики фиксируют, как клетки рассеивают свет и флуоресцируют, что позволяет исследовать их характеристики.
Метод проточной цитометрии позволяет получить большое количество данных, так как каждую клетку можно измерить по множеству параметров (размер, структура, количество флуоресцентных меток и т.д.). Чтобы правильно интерпретировать эти данные и разделить клетки на группы, используют алгоритмы кластеризации и классификации. Эти методы помогают автоматизировать анализ и находить закономерности в данных.
Кластеризация — это процесс группировки объектов (в данном случае клеток) на основе схожих характеристик. Клетки с похожими параметрами объединяются в кластеры, которые представляют собой популяции клеток с общими признаками. Этот процесс реализуется с помощью определённых алгоритмов.
Например, K-means (k-средних) — это популярный алгоритм, сортирующий данные на кластеры, имеющие аналогичные характеристики, например, по размерам и флуоресценции клеток. В результате на основе этих характеристик программа сгруппирует их в несколько кластеров . В частности этот алгоритм позволяет разделить популяцию бактерий на живые и мертвые.
DBSCAN (Density-Based Spatial Clustering of Applications with Noise) — это алгоритм, который объединяет клетки в кластеры, основываясь на плотности данных. Он хорошо подходит для разделения клеток с разными свойствами, когда кластеры могут быть не круглыми или неравномерными. В частности, этот алгоритм может быть использован для выявления редких типов клеток (например, мутантов) в общем массиве данных.
ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ IN SITU (FISH)
Метод Флуоресцентной гибридизации in situ использует флуоресцентные метки, связанные с олигонуклеотидами, которые связываются с конкретными последовательностями рРНК микроорганизмов. Это позволяет визуализировать и идентифицировать микроорганизмы в сложных биопленках или природных образцах, например, в сообществах бактерий в почве, воде и т.д..
Суть метода заключается в использовании специальных молекул (Флуоресцентные метки), которые светятся под ультрафиолетовым светом. Эти молекулы связаны с короткими фрагментами ДНК или РНК (олигонуклеотидами), которые специально разработаны так, чтобы они могли связываться с определёнными последовательностями рибосомальной РНК (рРНК) микроорганизмов (гибридизация), важными компонентами клеток, отвечающих за синтез белков, при этом, каждая клетка имеет свои уникальные последовательности рРНК. Это происходит только в тех местах, где последовательности рРНК точно соответствуют олигонуклеотидам. После того как метки связываются с рРНК, образец исследуют с помощью люминесцентной микроскопии (визуализация). Под ультрафиолетом флуоресцентные метки начинают светиться, проявляя клетки микроорганизмов, которые можно увидеть и сфотографировать.
Особенности FISH позволяют точно определить, какие микроорганизмы присутствуют в образце, потому что каждая группа микроорганизмов имеет уникальные последовательности рРНК. Помогает изучать сложные системы, такие как биоплёнки, где микроорганизмы живут в густых слоях. Это важно, например, для исследования бактерий в зубном налёте или в природных экосистемах (например, в почве или водоёмах). В отличие от методов, где нужно выращивать бактерии в лаборатории, FISH позволяет увидеть их прямо в образце, в их естественном состоянии. Это особенно полезно для изучения микробных сообществ, которые трудно выращивать в лаборатории.
ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ МИКРОМАССИВЫ
Фенотипические микромассивы — это современные лабораторные инструменты, используемые для изучения фенотипов микроорганизмов, т.е. совокупности видимых характеристик и свойств организма, зависимых от генов и условий среды. Они позволяют исследовать, как микроорганизмы ведут себя в различных условиях, как они реагируют на внешние факторы, и какие функции они могут выполнять.
Микромассив — это пластинка с множеством небольших лунок (обычно тысячи), каждая из которых представляет собой отдельную среду или условие для тестирования. В каждую лунку добавляют микроорганизмы и разные вещества для анализа. Оценка результата исследований осуществляется различными способами, например, с помощью цветовых или флуоресцентных меток, показывающих, насколько активно микроорганизм растёт или реагирует на определённые условия в каждой лунке. Это даёт информацию о том, какие фенотипические особенности он имеет.
В результате тестирования можно оценить особенности метаболизма микроорганизмов при использовании различных источников питания или энергии. Также фенотипический микромассив позволяет проверить, какие антибиотики эффективны против микроорганизма, а какие нет. Коме того, можно исследовать, какие вещества микроорганизмы способны разлагать, например, химические загрязнители в окружающей среде.
Заключение.
Данный обзор освещает широкий спектр различных современных методов и технологий для выявления микроорганизмов и их изучения.
Фенотипические методы, такие как микроскопия, окраска по Граму, биохимические тесты и культивационные подходы, по-прежнему являются обоснованными и востребованными в лабораторной практике. Несмотря на свою востребованность, данные методы имеют ограничения при изучении редких или трудно культивируемых исследований, что приводит к необходимости применения генотипических методов. Молекулярные методы, такие как ПЦР и секвенирование, обладают высокой эффективностью и скоростью исследования, что значительно улучшает определение и позволяет глубже анализировать генетические данные. Особая роль заключается в создании технологий нового поколения, таких как метагеномика и секвенирование полного генома, которые позволяют изучать микробиоты в их природной среде без необходимости культивирования.
Технологии CRISPR, MALDI-TOF MS, биосенсоры и микрожидкостные системы вносят постоянный вклад в совершенствование методов исследования исследований. CRISPR позволяет проводить высокоточный геномный скрининг с учетом мультиплексирования, что расширяет возможности генетического анализа. MALDI-TOF MS рекомендовал себя как быстрый и экономичный метод выявления наблюдений по белковому составу. Биосенсоры, особенно на основе нанотехнологий, обладают высокой чувствительностью и селективностью, что делает их составляющими в медицине и пищевой промышленности для быстрой диагностики. Проточная цитометрия и микрожидкостные технологии существенно упрощают для исследователя процесс анализа сложных микробных ассоциаций, что особенно важно в полевых условиях.
Метод FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) обеспечивает точную визуализацию микроорганизмов.
Фенотипические микромассивы предоставляют ценную информацию о метаболических и экологических функциях процессов, их устойчивости к антибиотикам, а также способности разлагать различные вещества. Эти технологии находят применение в биотехнологии, медицине и экологии.
Таким образом, интеграция фенотипических и молекулярных методов, а также внедрение современных технологий, таких как CRISPR, MALDI-TOF MS, биосенсоры и микрожидкостные системы, расширяет возможности микробиологических исследований. Эти подходы позволяют более точно определять детекторы, изучать их взаимодействие и взаимодействие с внешними условиями, что способствует развитию биотехнологий.